Nature Communications | 陈时盛团队与合作者成功克隆小麦抗叶锈病基因Lr.ace-4A/Lr30

小麦叶锈病是一种极具破坏性的真菌病害，严重威胁全球小麦的安全生产。克隆和利用抗叶锈病基因，培育抗病小麦品种是减轻这一威胁的重要手段。2025年10月22日，北京大学现代农业研究院陈时盛团队与合作者在国际知名期刊Nature Communications上发表了题为“Genome-assisted identification of wheat leaf rust resistance gene Lr.ace-4A/Lr30”的研究论文，通过组装高质量的硬粒小麦基因组，结合基因定位、EMS感病突变体及其转录组测序技术，成功克隆了来源于硬粒小麦地方品种PI 192051的抗叶锈病基因Lr.ace-4A，并证明该基因与普通小麦中Lr30为同一基因，为促进其在小麦育种中的应用奠定了基础。 

本研究发现来源于葡萄牙的硬粒小麦（T. durum）地方品种PI 192051对我国大部分叶锈菌流行小种表现出近免疫抗性。利用包含601个F₂单株的两个分离群体开展定位，发现PI 192051携带的Lr.ace-4A基因位于4A染色体上145.24Mb至536.89Mb之间，该区间存在重组抑制现象，很难缩小定位区间。为了克隆Lr.ace-4A，本研究对PI 192051进行了高质量的基因组测序和组装，构建了一个大小为10.51 Gb的染色体级别基因组图谱，Contig N50达到42.53 Mb，共注释了65,501个高置信基因（图1）。

图1、硬粒小麦PI 192051的基因组组装

随后，本研究构建了PI 192051的EMS突变群体，表型筛选获得7个独立的感病突变体家系。对获得的EMS感病突变体进行RNA-seq测序，并将数据比对到PI 192051参考基因组上。在Lr.ace-4A定位区域内，发现所有7个突变体都在同一个NLR基因（PI192051.r1.4AG0210600）上发生了典型的G/C到A/T的点突变（图2a-c）。注释发现该基因编码一个非典型NLR蛋白，包含两个串联NB-ARC结构域（图2d）。

图2、利用EMS突变体获得Lr.ace-4A候选基因

利用优化的CRISPR/Cas9系统敲除了四倍体小麦抗病亲本PI 192051中的该NLR候选基因。总计获得了39个独立的基因编辑转基因植株，其中32个植株发生了编辑。从中挑选了两个纯合编辑家系（分别产生1bp插入和1bp缺失）进行表型鉴定，发现完全敲除植株对叶锈菌小种PHQS表现为感病，而野生型PI 192051则保持抗病（图3a，3b）。进一步，我们从PI 192051中扩增出包含Lr.ace-4A完整编码区、内含子以及上下游调控序列的9.3 kb基因组片段，通过农杆菌介导转化到感病的EMS突变体m1中。所有携带该转基因片段的T₀和T₁代植株均恢复了对叶锈菌小种PHQS的强抗性，而未转化的m1对照仍表现感病（图3c，3d）。这些结果表明候选基因PI192051.r1.4AG0210600即为抗叶锈病基因Lr.ace-4A。

图3、Lr.ace-4A候选基因PI192051.r1.4AG0210600的功能验证

根据前人报道，来源于普通小麦的隐性抗叶锈病基因Lr30被定位在4AL染色体上。我们对Lr30单基因系RL6049中对应的基因进行测序，发现其基因区和UTR区域序列都与Lr.ace-4A完全一致。并且抗谱分析发现Lr30单基因系和Lr.ace-4A有一样的抗谱。然而，六倍体中Lr30仅表现出中等程度的抗性，抗性水平显著低于Lr.ace-4A在硬粒小麦PI 192051中的近免疫抗性水平。我们推测Lr.ace-4A在六倍体小麦背景下其抗性水平会显著降低。为验证该假设，我们将同样的9.3 kb基因组片段，通过农杆菌介导转化到六倍体感病品种Fielder中。结果显示，大部分转基因家系抗性水平明显减弱，表型与Lr30单基因系相当（图4a，4b）。此外，通过杂交与回交方法将Lr.ace-4A从四倍体转移到六倍体感病品种扬麦21后，其抗性也明显减弱。这些结果表明，Lr.ace-4A和Lr30为同一基因，该基因从四倍体小麦转移到六倍体小麦抗性降低。

值得注意的是，在Fielder转基因家系中，少数转基因家系（如T₁C652-12和T₁C652-27）因Lr.ace-4A拷贝数多/转录水平较高，抗性也显著升高，提示抗性强度与基因的拷贝数/表达量相关。因此，我们构建了Lr.ace-4A的过表达载体并转化到Fielder中，过表达的转基因家系抗性水平普遍高于转基因互补家系（图4c，4d）。

图4、Lr.ace-4A转基因互补和过表达转基因到普通小麦Fielder

单倍型分析发现，抗病单倍型与7种感病单倍型仅存在2个关键的多态性位点G1597A（E533K）和C1984T（R662C）。为了验证这两个位点的功能重要性，我们在9.3 kb基因组片段上分别引入碱基变化，构建了Lr.ace-4A^533K和Lr.ace-4A^662C的转基因载体，并分别转化到Fielder。结果显示，得到的转基因家系都是感病，表明这两个碱基对基因功能至关重要（图5a-c）。随后，我们分析了1000多份四倍体和六倍体小麦材料，发现抗病单倍型仅存在于1份硬粒小麦（PI 192051）以及2份普通小麦（RL6049和PI 619381）中。根据这两个关键碱基开发了Lr.ace-4A的诊断分子标记Lr30MAS-47FR，检测了309份二倍体/四倍体/六倍体小麦种质，发现该标记可以特异性识别抗病单倍型。

qRT-PCR分析表明，PI 192051中Lrace-4A基因受到叶锈菌诱导高表达。亚细胞定位结果显示其定位于细胞质和细胞核。在烟草叶片中瞬时表达Lrace-4A全长蛋白或其单独的结构域（CC, NB, LRR）均不会像阳性对照BAX那样产生明显的坏死现象。利用AlphaFold2进行的蛋白质结构预测显示，Lrace-4A的CC结构域以及NB-NB-LRR结构域均能形成五聚体的抗病小体（resistosome）结构（图5d-g）。综上所述，该研究将促进抗性基因Lr.ace-4A/Lr30的育种利用，为小麦抗叶锈病育种提供基因储备和材料基础。

图5、Lr.ace-4A关键碱基分析及其相关功能初探

北京大学现代农业研究院陈时盛研究员、河北农业大学王逍冬教授、北京大学现代农业研究院宋宝兴研究员为论文的共同通讯作者；北京大学现代农业研究院杨进威、李洪娜、宋瑞和河北农业大学李梦雨为论文共同第一作者。该研究得到了四川农业大学郝明教授、河南农业大学贾奥琳教授、华中农业大学兰彩霞教授、北京大学现代农业研究院梁岩岩、迟程研究员、邓兴旺教授、美国加州大学戴维斯分校Jorge Dubcovsky教授等人的帮助。感谢国家重点研发计划、山东省重点研发计划等项目的资助。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-64428-5